单细胞测序：实验设计和分析方法二

虽然从一群细胞中获得全基因组范围的mRNA抒发量对理解生物学机制十分有用，但这些方式只能获得平均基因抒发水平，有时侯会掩藏，甚至愚弄一些有意思的生物学现象。辛运的是，随着联发科量测序技术的迅速发展，我们可以获得单个细胞的转录组。

与大容积（bulk）RNA测序相比，单细胞RNA测序的数据结构似乎与其相同，但也有它不一样的特点：起始RNA非常少见、分辨率高（，即存在大量的基因有0值抒发的情况，图1a）、异质性高（，图1b）、基因抒发的分布复杂（，图1c）[1]。

图1：单细胞与大容积RNA-seq的优缺

sc：单细胞测序，bulk：大容积测序

针对单细胞测序的特性，我们先讨论单细胞实验设计、质量评估和抒发定量方面应当注意的问题。

1-单细胞测序的实验设计

为了防止有意思的生物学现象才不被样本打算或数据搜集过程中形成的表象和额外混杂变量（）所掩藏，应把各类相关变量随机化处理。须要注意的是，在实验过程中实验设计与分析，往往由于资源有限（如样本、单细胞分离设备、测序仪、预算等），完全随机化的设计并不现实。大多数情况下，样本是分批次（batch）打算的。比如分离胚胎发育过程中的1,2,4,8期的细胞：每位批次细胞应包含各期不同发育阶段的细胞。这样可使批次效应与发育时段变量不会混杂（）。Hicks等人[2]提出一种合理的实验设计为：在每位批次的样本中应同时出现不同生物学处理的样本，测序过程应按照大容积测序方式随机化样本处理（run，flowcell，lanes等）。基于此设计，数据剖析人员易从系统实验偏好（bias）中调整批次效应等无关变量。

单细胞测序实验的建库方式、测序平台和单细胞分离方式就会对测序覆盖度（）和链特异性形成一定的影响。另外，是否要加入spike-ins，以及UMIs也是须要谨慎考虑的问题。Spike-ins的使用含量一般很高，结果会抢占很大比列的测序reads。最新的Drop-seq技术也还不能使用spike-ins。UMIs在清除扩增偏好性方面十分有用，而且不能用于研究基因异构体和allel特异抒发。

总而言之，记录越多的影响诱因，越对下游数据剖析有利。另外，影响单细胞测序的变量也很可能来始于系统偏差。

2-单细胞测序的质量评估

在估算各个细胞的抒发量之前，应对原始测序数据、转录组比对数据、单细胞搜集质量进行评估，并消除低质量细胞。低质量是指：细胞断裂或死亡、捕获单细胞的设备上没有细胞、设备上有不止一个细胞存在[3]。直接用显微镜镜检的方式可以去除低质量样本。大容积测序常用的质量评估软件如、、RSeQC也可以用于检测测序后的细胞质量。

如使用：

$.fq

转录组比对数据的检测也是常用的质量评估手段。得知有多少测序序列比对到rRNA/tRNAs、特异比对到基因组的测序序列、跨外显子的测序序列和转录本的测序深度等信息十分有助于细胞质量的评估。

如使用RSeQC：

$/.py-iinput.bam-r.bed-o.txt

$/.py-iinput.bam-r.bed-o.txt

$/.py-iinput.bam-r.bed-o.tx

须要注意的是，质量评估的结果应参考单细胞测序的实验方案。选择带polyA的RNA进行测序（除去rRNA），其测序的覆盖度会形成3’偏好性。如右图所示，3个有严重3’偏好性的细胞应在下游定量剖析中除去。

3-单细胞测序的抒发定量

下一步就是对每位细胞基因抒发水平进行定量。对于mRNA来说，可以直接使用大容积测序的定量工具，常用工具有：HTseq、、RSEM和WemIO等。

如使用：

#

$-O-M-Q30-p-a.gtf-oinput.bam

#

$-Q30-p-a.gtf-oinput.bam

值得一提的是，大容积测序中用于表征相对抒发量的方式（FPKM/RPKM，TPM）不适用于单细胞测序。这种方式假定每位细胞的RNA总数相同，且相同基因在不同细胞中抒发量一致。因基因抒发具有随机性（），该假定不创立。因而实验设计与分析，单细胞测序实验中最常使用UMIs，以得知单细胞内mRNA分子的绝对数目，之后对不同细胞的基因抒发量进行比较。